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不同品係小白菜鎘脅迫轉錄組比較分析

合作老師:中山大學 周倩博士

文章下載鏈接:http://www.gaswe.cn/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467359509.1009325.pdf

研究背景
土壤中重金屬含量對植物、人類健康產生的環境危害問題愈發嚴重。
植物葉組織中的Cd來源於根組織,根部Cd耐受程度決定葉中Cd含量高低。
不同品係小白菜對Cd吸收及累積能力有明顯差異。
前期研究證明,高鎘積累品係(HAJS)小白菜的細胞壁、葉綠體、組織溶酶體中Cd含量均高於低鎘累積品係(LAJK)
但轉錄水平差異及調控原理尚不清晰。

研究目的
研究基因水平上,不同處理時長、不同品係(高鎘累積和低鎘累積品係)小白菜對鎘脅迫應答反應的差異。
研究兩種品係對鎘吸收累積能力的差別是由哪些遺傳基礎決定的。

研究思路

分組進行趨勢分析
1.在同一品係中,不同處理間進行趨勢分析, 發現各品係在Cd刺激過程基因表達模式差異;
2.比較不同品係間,顯著趨勢間的差異,推測兩品係應答速度、主要GO term,pathway的差異;
3.比較不同品係間,相同處理下的差異,推測參與完整應答反應過程並造成品係間差異的關鍵基因。

一、基礎研究
1.發現差異

前期實驗中,作者通過對兩種品係小白菜受Cd刺激後連續多個時間點根部Cd濃度的檢測發現兩種品係間存在顯著差異,其中關鍵時間點包括:

未經Cd處理組(T0)兩品係中檢測出的Cd濃度無差異;
Cd處理3h後(T3)HAJS組Cd濃度是LAJK組2.9倍;
Cd處理23h後(T24)HAJS組Cd濃度也顯著高於LAJK組(P<0.01)

 

為研究轉錄水平上兩種品係產生Cd累積差異的原因,作者對兩品係未受Cd刺激及Cd刺激後3h、24h的根部組織進行了RNA-seq。

二、轉錄組分析

對6組Mixed RNA測序結果進行過濾、拚接組裝後得到參考序列,再將HAJS和LAJK兩品係的測序結果與參考序列進行比對得到兩品係轉錄組。
再分別對兩品係內不同處理間的結果進行比對分析後找出處理間的差異表達基因(DEGs)。

結果顯示,兩種品係間的DEGs數量差異顯著,各處理間不倫上調或下調,HAJS品係中的差異基因數量都顯著高於LAJK品係。
表明相對LAJK品係,HAJS品係對Cd刺激的應答反應更“迅猛”。

三、品係內DEGs趨勢分析

獲得DEGs後,分別對各品係內所有的DEGs進行趨勢分析,各得到3種Cd應答過程中產生的顯著趨勢。
通過對兩個品係間顯著趨勢的比較發現:

四、功能富集分析
隨後作者又分別對不同品係各顯著趨勢中的DEGs進行GO功能富集分析。

HAJS品係中,Cd刺激應答過程顯著富集的基因包含於細胞壁合成、穀胱甘肽合成、熱休克蛋白合成(HSPs, 起維持蛋白質穩定性,在重金屬脅迫中保護植物細胞作用)、糖代謝等GO term中。

LAJK品係中,Cd刺激應答過程顯著富集的基因包含於DNA合成修複、脫落酸代謝合成、含氧化合物反應等GO term中。
上述結果進一步表明,HAJS品係小白菜不僅對Cd刺激早期應答反應速度更快,且兩品係參與應答反應的主要功能基因不同。

五、qPCR驗證

隨機挑選8個不同表達模式的基因進行qPCR檢測,對RNA-seq結果進行驗證。結果顯示與測序數據相關性良好。(r=0.683,P<0.0001)

六、Cd積累相關通路分析
接著,作者又對對不同品係中,顯著趨勢中的DEGs進行pathway分析,發現三條重要通路。

1.細胞壁合成通路增強導致高鎘累積型(HAJS)小白菜表現出高Cd耐受
HAJS小白菜對Cd脅迫應答反應中,穀胱甘肽(GSH)與Cd結合過程起主要作用,而HAJS型小白菜中Cd的高累積量與植物螯合物(PC)的轉移密切相關。

2.解旋酶合成增強LAJK在轉錄水平對早期Cd脅迫的應答反應敏感性
在LAJK小白菜中,Cd刺激後3h大量表達並注釋到核糖體形成、DNA複製通路的基因大部分屬於解旋酶(Helicase)合成過程,而酶催化是DNA合成的第一步,所以,Cd釋放後早期應答與DNA合成修複相關基因有關。低劑量Cd刺激可以誘導增強DNA複製,從而抵抗Cd脅迫。

3.脫落酸(ABA)誘導的抗氧化信號轉導通路是區分兩種品係差異的關鍵
ABA信號轉導通路中,LAJK中編碼PYR/PYL(脫落酸受體複合體)上調,抑製SnRK2s蛋白的基因並從中釋放PP2Cs基因最終影響具有調節滲透壓功能的DREB2A基因,抑製Cd積累。但在HAJS中,這條通路被抑製。  

七、品係間差異分析
最後,對不同品係間,相同處理條件下的基因進行差異分析,找出DEGs,並進行功能富集分析。

Cd在植物體內是通過陽離子轉運進入細胞內,而Cd轉運相關基因在Cd累積過程扮演重要角色,由此,進一步篩選出Cd轉運相關的93個DEGs,進行分析。

分析發現,96個DEGs中中參與編碼Cd排放基因PDR8的基因僅在LAJK中大量表達,導致LAJK品係小白菜根部Cd吸收能力及Cd積累能力低;

而參與編碼Cd吸收轉運基因YSL1的基因僅在HAJS中大量表達,導致HAJS品係小白菜根部對Cd高耐。

結  果
1.相對LAJK品係HAJS品係對Cd脅迫應答反應產生更快。Cd在小白菜中累積能力與轉錄水平Cd脅迫應答反應速度有關。
2. 功能富集分析表明HAJS品係中調控細胞壁合成、穀胱甘肽(GSH)合成代謝的基因也參與了Cd脅迫應答反應;LAJK品係中則主要是調控DNA修複和脫落酸(ABA)信號轉導通路的基因參與Cd脅迫應答。
3. 參與Cd排放的基因PDR8在LAJK品係大量表達;負責Cd轉運的基因YSL1在HAJS中表達量增多,表明在LAJK和HAJS兩種品係中Cd轉運機製不同,從而導致Cd自然累積能力差異。

文章數據挖掘特點

比較兩組樣本趨勢變化差異, 推斷不同品係應答模式的快慢;
從差異趨勢中,找出差異的pathway或 GO term,證明不同品係Cd應答通路的差異;
結合以上結果,比較不同品係在相同處理下的基因表達差異,結合功能富集分析,挖掘出不同品係產生Cd應答反應差異的關鍵基因。

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