鐵皮石斛轉錄組分析與其在鑒定多糖合成相關基因中的應用

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研究背景
•鐵皮石斛是蘭科 （Orchidaceae）植物中著名的藥用植物，數百年來被用於退燒、明目，有免疫功能調節的功效。
•霍山產鐵皮石斛（D. officinale）的莖部富含葡萄糖和甘露糖等多糖，這些多糖憑借其抗氧化、免疫刺激和抗腫瘤的功能已被證明是重要的生物活性物質。然而，參與鐵皮石斛多糖合成與代謝通路的編碼基因仍所知甚少，並且迄今隻有一種石斛蘭科植物基因組已知，相關基因組信息十分有限。

研究目的
•通過構建幼年和成年兩個鐵皮石斛轉錄組參考序列數據庫，比較差異基因，找出與次生代謝物多糖合成相關的基因。

研究樣品：
華南植物園溫室培育霍山產鐵皮石斛

文章脈絡

1.測序組裝與注釋
1.1測序組裝結果統計
  幼年組A：將1.02億條reads組裝成107,086條contigs，拚接成93,881 條unigenes
  成年組B：將0.86億條reads組裝成129,235條contigs，拚接成114,098 條unigenes
    
1.2 COG功能分析
比對COG database後，25,982條unigenes被分為25個功能分類，
其中最顯著的是General function prediction only，有7861條 unigenes (30%)匹配。

1.3 Unigene的GO分析結果統計
GO分析結果表明大多數基因都和生物代謝通路相關。

1.3 Unigene的KEGG代謝通路結果分析
兩組共得到的unigenes中有17,281條比對到KEGG數據庫，其中135條注釋到果糖甘露糖代謝通路。
果糖和甘露糖也是該植物中主要合成的多糖。轉移酶是否在這些通路裏。

果糖和甘露糖具體代謝通路

2.目標基因的尋找與篩選
所有Unigenes對比CAZy數據庫進行BLASTX分析後發現目的基因：
•糖基轉移酶
糖基轉移酶相關基因430條，分別歸屬於35個GT家族。其中糖基轉移酶GT39隻存在於霍山產鐵皮石斛中。

•纖維素轉移酶
纖維素轉移酶相關基因405條，屬於霍山產鐵皮石斛CesA大家族的89條並挑選19條unigenes畫出係統進化分析樹發現它們分別歸屬6個CesA家族的。

2.1差異基因篩選
為尋找兩個發育階段的差異基因，比對幼年株和成年株兩個數據庫，共得到32,794條差異基因。

相對幼年株，成年株中有22051條上調DEGs；                       兩個數據庫中有27.97%為DEGs，10743條下調DEGs

找出了這些代謝通路及次生代謝物合成主要相關的差異基因，再對它們進行後續分析。

2.2 目標基因及轉錄因子相關的差異基因篩選
找出兩組數據庫比對出的DEGs中，與糖基轉移酶和纖維素轉移酶相關的基因進行比對分析
•糖基轉移酶

170個GTs在幼株和成年株中差異表達數最多
 

•纖維素轉移酶

差異表達基因的Csls家族分類

差異表達基因的GTs家族分類

2.2 轉錄因子相關的差異基因篩選
轉錄因子TF被認為是重要的介導次級代謝通路的因子。
在鐵皮石斛幼年和成年轉錄組中比對出的627個TFs都與多糖合成代謝相關。以轉錄因子MYB為例，相對幼年株，成年株中上調的35個轉錄因子有可能與次代謝調控相關；下調的47個轉錄因子則有可能與細胞壁形成等形態學調控相關。

3 關鍵酶基因表達量的驗證
18個GT合成相關的編碼基因被隨機挑選用qRT-PCR方法驗證其在幼年株和成年株中表達量的變化。

結果與測序結果一致，各基因在幼年和成年階段的鐵皮石斛中均存在差異表達，再次驗證這些基因參與次生代謝無多糖的合成代謝調解。

結  果
1.  構建幼年和成年兩個鐵皮石斛轉錄組參考序列數據庫；
2.  鑒定出大量與糖基轉移酶、纖維素轉移酶合成代謝通路相關的基因；
3. 比較幼年和成年株的鐵皮石斛中與多糖合成代謝相關的差異基因，發現是由GT家族、TF家族中的多種基因共同參與調解其次生代謝通路。