蘋果小RNA文獻解讀

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研究背景與目的
在黃土高原地區，綠蘋果（Granny Smith）在成熟期摘袋複照後會變紅，已有研究證明蘋果皮中一些miRNA的表達受不同光照條件的影響。而蘋果著色度是蘋果品質的重要指標之一。為此，研究人人員發現並分析了果皮中miRNA在摘袋後複照過程中所起的作用。

目的：通過檢測Granny Smith的小RNA找出導致摘袋複照後果皮變紅的miRNA。

研究樣品
西北農林科技大白水蘋果研究所，6個Granny Smith混合蘋果皮樣本：
實驗組：落花後第10d/40d套袋，於第120d/160d摘袋，摘袋後重新暴露於自然光照中，分別於摘袋後0h,6h,1d采摘。
對照組：未套袋和實驗組來自同一顆果樹，在自然光照下成熟並在相同時間采摘。（每組均為來自10棵蘋果樹的20顆蘋果皮混樣）

文章脈絡

1、測序結果
    •建立了6個Granny Smith蘋果皮sRNA數據庫T1\T2\T3\N1\N2\N3
    •47%比對到蘋果基因組，miRNA約占sRNA總數的8.5%，且長度分布合理。

2、miRNA的鑒定
    •分屬43個蘋果miRNA家族的201條miRNA序列被檢測到。
    •其中miR156、miR171、miR172家族所占比例最多。
    •已有研究證明在蘋果樹中大量積累的MIR477、MIR482、MIR3627在蘋果皮中也發現被大量積累。
    •比對蘋果基因組參考序列、non-coding rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、miRBase後得到220個新miRNA。

3.1、差異表達miRNA分析（組間）
套袋和不套袋組間比較後
•共發現屬於54個miRNA家族的126個miRNA差異表達。
•說明：套袋前後，Granny Smith蘋果皮中部分miRNA差異表達。

3.1、差異表達miRNA分析（組內）
套袋後不同複照時長組比較後
•發現T1、T2組中有24個miRNA差異表達。
•上述結果說明，套袋後光照時間長短會影響蘋果皮中部分miRNA的表達水平，不同光照條件可以調節一些miRNA的表達。
•那麼這些miRNA作用於哪些靶基因？這些靶基因又是否對蘋果皮變紅有影響呢？研究人員又進行了靶基因預測和功能通路富集分析。

3.2、差異表達miRNA的靶基因預測
•從已知miRNA中獲得1334個目標mRNA，從新miRNA中獲得1055個目標mRNA。
•篩選出套袋和未套袋組間差異表達的miRNA靶基因進行GO、KEGG富集分析，對靶基因功能進行預測。

•通過GO功能富集分析，發現差異表達的關鍵miRNA的靶基因功能多存在於花青素合成代謝等細胞進程、代謝進行和刺激應答過程。
如miR156：靶基因為轉錄因子MdSPL,受紫外線輻射調解；
miR828：靶基因為轉錄因子MdbHLH ，參與花青素合成代謝調控
miR858：靶基因為轉錄因子MdMYB9，參與花青素合成代謝調控； 
•通過KEGG通路富集分析，發現關鍵miRNA的靶基因都屬於蘋果皮的抗氧化通路, 類黃酮生物合成,花生四烯酸代謝,穀胱甘肽過氧物酶代謝等。其中類黃酮生物合成已被證明對植物抗UV輻射起關鍵作用。
•靶基因功能分析說明，摘袋後果皮變色是Granny Smith為了應對環境壓力的一種光保護作用，而花青素的累積增多，就是最顯著的表現。

4、 qRT-PCR驗證

•試驗中套袋組果皮中花青素含量極低，摘袋後均上升。
•qRT-PCR檢測miRNA和對應的靶基因表達量發現3種miRNA：miR156、 miR828、miR858共同作用調控GrannySmith中花青素合成積累。

研究結果
•發現已知miRNA201個，novel miRNA220個。
•套袋和未套袋果皮中存在差異表達的miRNA，且它們的靶基因多參與調控花青素合成代謝。
•找出3種與Granny Smith果皮中花青素合成代謝相關的miRNA: mi156、miR828、miR858